Мутагенность

Исследование мутагенности новых фармакологических средств и вспомогательных компонентов лекарственных форм проводятся на этапе доклинического изучения и предусматривают оценку способности лекарственных средств к индукции разных типов мутаций в зародышевых и соматических клетках.

С этой целью используют комплекс методов, выполняемых на разных тест-объектах. Опыт работы по тестированию лекарств, накопленный различными группами исследователей с момента выхода первой редакции «Методических рекомендации по оценке мутагенности новых лекарственных средств» (1981), показывает, что на доклиническом этапе исследования целесообразно применение следующего набора тестов для оценки лекарственных средств на мутагенность:

-тест на индукцию генных мутаций (тест Эймса на Salmonella typhimurium или учет рецессивных, сцепленных с полом, летальных мутаций/соматической рекомбинации у дрозофилы)

-тест на индукцию хромосомных повреждений in vivo (учет хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих либо учет микроядер в клетках костного мозга или периферической крови млекопитающих).

Регламент выполнения рекомендованных методов изучения мутагенности и алгоритмы трактовки экспериментальных результатов описаны в соответствующих разделах, общие вопросы по генотоксикологии лекарственных средств изложены ранее.

Исследование мутагенных свойств фармакологических средств, так же как и экспертную оценку результатов, должны проводить специалисты, имеющие достаточные профессиональные навыки по применению методов, составляющих систему тестирования. Данные методические рекомендации описывают комплексную систему проверки генетической активности новых лекарственных средств, но не является пособием для освоения методов. Последние в должном объеме можно освоить только в результате стажировки в лабораториях соответствующего профиля.

Общие подходы

Тестированию на мутагенную активность подвергаются новые оригинальные фармакологические средства, созданные химическими, биотехнологическим генно-инженерными и иными способами, включая полученные из сырья природного происхождения и фитопрепараты, а также новые фиксированные комбинации фармакологических средств, планируемые для широкого клинического применения.

В случае получения положительных результатов в обоих тестах делается заключение о наличии мутагенной активности и препарат не подвергается дальнейшим испытаниям.

В случае получения положительного результата только в тесте на индукцию генных мутаций необходимо проведение дополнительного исследования на индукцию ДНК-повреждений в различных органах и тканях млекопитающих in vivo, с включением в анализ зародышевых клеток.

При условии получения отрицательных результатов препарат может быть допущен к 1-ой и 2-ой фазам клинических испытаний.

Перед 3-ей фазой клинических испытаний необходимо провести изучение способности лекарственного препарата индуцировать мутации в зародышевых клетках (метод учета доминантных летальных мутаций у мышей).

В случае получения в экспериментальных тестах результатов, не позволяющих с полной определенностью сделать заключение о мутагенных свойствах тестируемого фармакологического вещества, на заключительных этапах клинических испытаний (3-я фаза) следует провести исследование  методами учета хромосомных аберраций и/или повреждений ДНК в клетках периферической крови леченых больных.

Оценку мутагенности лекарственных средств проводят в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств под редакцией А.Н. Миронова, Н.Д. Бунатяна и др., М., издательский дом «Гриф и К», 2012, и FDA Guidance for Industry and Review Staff Recommended Approaches to Integration of Genetic Toxicology Study Results.

Исследование мутагенных свойств тестируемого препарата проводят в соответствии с протоколами ОЭСР по испытанию химических веществ:

471 Бактериальный тест обратных мутаций (тест Эймса с метаболической активацией и без нее)
473 Тест хромосомных аберраций на млекопитающих in vitro
474 Микроядерный тест на эритроцитах млекопитающих
475 Тест хромосомных аберраций на клетках косного мозга млекопитающих
476 Тест генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro

 

Тест Эймса (мутационный тест на бактериях Salmonella typhimurium)

Данный метод предназначен для обнаружения способности фармакологических веществ или их метаболитов вызывать генные мутации в штаммах-индикаторах бактерий Salmonella typhimurium. Мутационный тест выполняют в формате микротитрационного планшета с использованием набора Ames MPF™ 98/100/1535/1537 (Xenometrix, Швейцария). Используют штаммы бактерий Salmonella typhimurium. В оперон гистидина (His) бактерий S. typhimurium вводят точечные мутации, что приводит к нарушению синтеза гистидина и утрате способности бактерий расти на среде, не содержащей гистидин. Индукция обратных мутаций в результате влияния мутагена по типу замены комплементарных пар оснований или сдвигу рамки считывания в гене His этих тестовых штаммов приводит к возврату прототрофии бактерий на гистидине и способности расти на среде без гистидина. Тестовые штаммы подвергают обработке тестируемым образцом в различных концентрациях и выращивают на среде, не содержащей гистидина. Мутагенный потенциал оценивают по индукции ревертантов от ауксотрофии на гистидине и способности расти на среде без гистидина. Штаммы бактерий S. typhimurium, обозначенные как TA100 и TA1535, позволяют регистрировать индукцию мутаций по типу замены комплементарных пар оснований, штаммы TA98 и TA1537 – мутации по сдвигу рамки считывания.

image054

Колонии мутанта (желтые лунки) по секциям в 384-луночном планшете после 48 часов инкубации: секция 0 – отрицательный контроль (растворитель); секции 1-6 – тестируемое вещество в различных концентрациях: в секциях 3-4 наблюдаем мутагенное действие тестируемого вещества, секции 5-6 – цитотоксическое действие тестируемого вещества; + — положительный контроль