Иммунотоксичность при однократном и курсовом введении

В последние два десятилетия возрастающее количество публикаций о повреждающем действии на иммунную систему факторов загрязнения окружающей среды и ряда лекарственных препаратов привело к формированию самостоятельного научного направления — иммунотоксикологии.

Иммунотоксикология зародилась во второй половине 70-х годов XX столетия. В 1979 г. в «Анналах Нью-Йорской Академии наук» публикуются материалы первого симпозиума, посвященного данному вопросу, а в 1983 г. в журнале «Immunology Today» впервые было формально заявлено о возникновении нового научного направления — иммунотоксикологии, как результата слияния иммунологии и токсикологии.

Иммунотоксикология в исследовательском плане определяется как наука, занимающаяся идентификацией и анализом внешнесредовых агентов, химических, пищевых и лекарственных факторов, которые вызывают изменения иммунитета.

Первое десятилетие существования иммунотоксикологии было ознаменовано развитием исследований по следующим направлениям.

Доказательство того, что иммунная система организма может являться мишенью поражающего действия ксенобиотиков.

Подтверждение того, что иммуносупрессия, гиперчувствительность и аутоиммунные процессы могут являться нежелательными последствиями воздействия ксенобиотиков.

Разработка стандартной группы тестов для изучения иммунотоксичности на грызунах.

К настоящему времени поле научных интересов в области иммунотоксикологии представляет собой четко ограниченную область иммунологии, основывающуюся на токсикологических принципах. Так как во всем мире в обществе растет понимание важности связи между иммунитетом и общим состоянием здоровья человека, значение иммунотоксикологии возрастает до степени жизненно важного междисциплинарного направления.

В настоящее время иммунотоксикология как научное направление полноправно присутствует в программах большинства токсикологических исследовательских учреждений.

В отличие от установленных Протоколов доклинического изучения общетоксического действия, методологические и методические проблемы исследования иммунотоксического действия фармакологических средств до настоящего времени остаются предметом поиска и дискуссий во всем мире.

В нашей стране был разработан ряд соответствующих методических рекомендаций, регламентирующих изучение влияния на иммунную систему фармакологических средств, изучение аллергизирующего и иммунотоксического действия потенциальных лекарственных препаратов.

Под иммунотоксическим действием традиционно понимают модифицирующее влияние ксенобиотиков и лекарственных средств на иммуногенез, включая иммуносупрессию и гиперстимуляцию иммунитета, способное привести к снижению резистентности организма к инфекции, повышению риска онкологических заболеваний, развитию аутоиммунной патологии и аллергизации организма.

Основная задача доклинического изучения влияния потенциальных лекарственных средств на иммунную систему состоит в том, чтобы в эксперименте на животных доказать или исключить возможность развития иммунотоксического действия, вызванного фармакологическим средством или его метаболитами.

Предложенный подход к оценке иммунотоксического действия фармакологических средств заключается в исследовании ряда интегральных иммунологических функций, позволяющих, с учетом результатов гематологических и морфологических исследований лимфоидных органов, оценить возможный риск при применении нового фармакологического средства.

Общие положения

Обязательному тестированию на иммунотоксичность должны подвергаться новые, оригинальные фармакологические средства, а также известные лекарственные средства, для которых отсутствуют данные об изучении иммунотоксичности, рекомендуемые:

а) для применения длительными повторными курсами;

б) применения в детской практике, а также для лечения беременных женщин и при назначении в период лактации;

в) в качестве профилактических средств и контрацептивов;

г) для использования без назначения врача среди широких слоев населения.

Рассматривается индивидуально вопрос об изучении иммунотоксичности препаратов:

а) предназначенных для лечения злокачественных новообразований;

б) однократно или коротким не повторяющимся курсом.

Тестирование не обязательно для препаратов, предлагаемых:

а) для лечения заболеваний, представляющих непосредственную угрозу для жизни;

б) для средств, безопасность применения которых была изучена в рамках исследования специфической активности;

в) воспроизводимых отечественных и зарубежных лекарственных средств, если в литературе имеются достаточно обоснованные сведения экспериментального и ретроспективного характера, подтверждающие отсутствие иммунотоксических свойств соответствующего аналога.

 

2. Методология иммунотоксического тестирования

Главной задачей иммунотоксикологии является разработка стратегии оценки состояния иммунитета, которая позволит четко прогнозировать последствия влияния экзогенных факторов на иммунную систему человека.

Наиболее подробно и тщательно вопросы методологии иммунотоксикологического исследования были рассмотрены в 1994 г. на рабочем совещании, состоявшемся в Арлингтоне (США).

При тестировании на иммунотоксичность предлагается использовать этапный подход, как правило, двух- или трехуровневый. При оценке иммунотоксичности приоритет отдается функциональным методам иммунологического исследования, морфологические и гистологические исследования служат дополнением. На совещании большое внимание уделялось стандартизации методов: валидность метода (селективность, специфичность, чувствительность, точность и воспроизводимость); выбор животных (видовые и генетические особенности); межлабораторная верификация исследований.

Существующие представления о ходе развития защитных реакций иммунной системы свидетельствуют о том, что в эксперименте обнаружить повреждения в иммунной системе под воздействием химических или фармакологических средств с большей вероятностью можно при использовании модели антигенного стимула, т. е. на фоне развития специфического иммунного ответа, включающего в себя все этапы иммунного реагирования.

При обсуждении условий проведения исследований иммунотоксических свойств фармакологических средств наибольшие дискуссии вызывают вопросы выбора методов, доз и схем введения исследуемого препарата.

Накопленный 20-летний опыт изучения иммуномодулирующего и иммунотоксического действия фармакологических средств определяет использование комплексного подхода. Этот подход включает в себя изучение действия исследуемого соединения как при однократном введении в широком диапазоне доз, различающихся на 3—4 порядка, так и при курсовом введении в дозах, отобранных при однократном введении с учетом дозы, рекомендуемой для клинического изучения и ЛД50 препарата.

Однократное введение фармакологического средства с перерывом в 1 ч от введения антигена позволяет выявить прямое действие на иммунные реакции и на клетки иммунной системы. Курсовое введение позволяет оценить и непрямое иммунотоксическое действие, связанное с нарушением органов и систем организма, сопряженных с иммунной системой (нервная и эндокринная системы, печень и др.).

Для предварительного анализа иммунотоксичности фармакологического средства могут быть использованы:

— данные литературы о влиянии на иммунную систему аналогов или близких по действию и химической структуре веществ;

— результаты изучения общетоксического действия, полученные при изучении подострой и хронической токсичности.

 

Оценку иммунотоксичности фармакологических препаратов проводят в соответствии с Руководством по проведению исследований лекарственных средств. Под редакцией А.Н. Миронова, Н.Д. Бунатяна и др., издательство «Гриф и К», 2012; FDA – Иммунотоксикологическая оценка исследуемых новых лекарственных средств, ICH – S8, а также на основании следующих тестов:

  • Оценка гуморального иммунного ответа (определение титра антител к эритроцитам барана в сыворотке мыши посредством гемагглютинации);
  • Оценка клеточного иммунного ответа (в реакции гиперчувствительности замедленного типа к гаптену или эритроцитам барана);
  • Оценка фагоцитарной активности (фагоцитоз латексных ФИТЦ-меченных частиц перитонеальными макрофагами мыши).

 

Микроскопическая оценка фагоцитоза латексных частиц

image043 image045

Микроскопия в проходящем свете, 100×

image047 image049

Флуоресцентная микроскопия, 100× (поглощение – 495 нм, эмиссия – 517 нм)

 

  • Оценка действия тестируемого препарата на приобретенный иммунный ответ посредством теста пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов, выделенных из селезенки мыши;
  • Анализ уровня иммуноглобулинов методом ELISA (дополнительно);
  • Анализ уровня цитокинов методом ELISA (дополнительно);
  • Анализ гематологических показателей (таких как число лейкоцитов и лейкоцитарная формула) (дополнительно);
  • Анализ хемотаксиса нейтрофилов и макрофагов (дополнительно);
  • Исследования in vitro на клеточных линиях (ингибирование/стимуляция провоспалительного каскада, анализ цитокинов, таких как IL-1β, TNFα, IL-6 и т.д.) (дополнительно);
  • Оценка взаимодействия с TLR-рецепторами in vitro (дополнительно).